POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU ( PCR)

Polimeraz Zincirleme Tepkimesi (Polymerase Chain Reaction – PCR), DNA İçerisinde yer alan, dizisi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan bir metottur. PCR yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisinde parmak izlerinin tanısında kullanılmaktadır. Ayrıca PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı Taq Polimeraz enziminin Bulunması yapmıştır zira bu enzim yüksek sıcaklıklarda dahi dayanabilen yegâne Enzimdir. Bu enzim Kızıldeniz’in sıcak bölgelerinden birinde yaşayan bir Mikroorganizmadan elde edilmiştir. Dr. Kary B. Mullis 1980’li yıllarda yaptığı PCR Çalışmaları ile 1993 yılında Kimya alanında Nobel ödülü almıştır.Daha sonraları çeşitli amaçlarla kullanılan bu metot sayesinde Tıp, ziraat ve Genetik ile ilgili bilim dallarında yaygın bir kullanım alanı bulmuştur. İnsan hastalıklarının teşhisi, patojenlerin tanısı, küçük miktarlardaki örneklerde konukçu genetik materyalinin saptanması, farklı kaynaklardan elde edilen DNA’lar arasındaki genetik akrabalığın saptanması, genetik klonlama ve baz dizilişi tespiti olarak sıralanabilir.

 

PCR BASAMAKLARI

 Çoğaltılacak DNA denatüre edilerek (94°C’de 5 dakika) tek zincirli hale getirilir.

Isıya dayanıklı bir DNA Polimeraz olan Taq DNA Polimeraz reaksiyon ortamına ilave edilir. DNA’nın çoğaltılması 72°C’de gerçekleşir.

 1. Denatürasyon

 - Hedef DNA’nın ilk Denatürasyon çok zor olabilir. Bu sebepten dolayı PCR İşlenme başlamadan önce içerisine Taq DNA Polimeraz katılmamış karışımların Bulunduğu ependorf tüpleri PCR cihazının sıcaklığı 100ºC’de 10 dakika kadar bekletilir. Sonra Taq DNA Polimeraz katılarak normal döngü işlemi başlatılır.

2.Primerle eşleşme  (Annealing)

Primer eşleşme ısı aşırısı için en önemli parametredir Her primer için değişken olan karakteristik bir özelliktir.Primerlerin kaç bazdan oluştuğu,baz çeşitliliği ve ortamın iyonik kuvvetinden etkilenir. Teorik olarak hesaplanabilmektedir, fakat en doğru değer deneysel olarak belirlenir. En uygun Tm sıcaklığını belirlemek için gradientli PCR yapılır.

3. Uzama (Extension)

 - Uzama safhası genellikle DNA Taq polimerazın en iyi çalıştığı sıcaklık olan72ºC’de gerçekleştirilir.

 - Süresi çoğaltılacak hedef DNA’nın uzunluğuna göre  ancak genellikle 1-2 dakika yeterlidir.

4. Döngü sayısı

 - Döngü sayısı arttıkça ürün miktarı artar.

 - Genellikle 25-35 döngü yeterlidir.

 - Döngü sayısı çok olduğu zaman spesifik olmayan bağlanmalar olacağından (yanlış ürünlerin) miktarı da artar ve ürün kirlenir.

 5. PCR’INTEMEL BİLEŞENLERİ

 1- Çoğaltılacak DNA bölge

2- Çoğaltılacak bölgeyi kopyalayacak olan DNA Polimeraz enzimi,

3- Yeni zincirin yapımında kullanılacak olan deoksinükleotid trifosfatlar,

4- DNA Polimeraz enzimi için gerekli olan kimyasal ortamı sağlayan tampon sistemi.

 

 1. Kalıp DNA:

PCR için her türlü kaynaktan temin edilen DNA (veya RNA) kullanılabilir. Çoğaltılacak kalıp DNA’nın diziliminin tam bilinmesi gerekmez. Bir PCR için başlangıç materyali, çoğaltılacak olan baz dizisine sahip genetik materyaldir. Eğer çoğaltılacak materyal olarak RNA’dan faydalanılacaksa, Reaksiyon başlamadan önce RNA, komplementer DNA’ya (cDNA) çevrilir ve sonra da bu cDNA, PCR için bir kalıp olarak görev yapar ve reaksiyona aynen DNA’daolduğu gibi Taq Polimeraz enziminin ortama ilavesiyle devam edilir.

 

2.Primerler (Oligonükleotidler):

 Sentez için basamak oluşturan, DNA’yı PCR tekniği ile çoğaltabilmek için kullanılan, kalıp DNA ile eşleşecek 20-40 bazlık sentetik oligonükleotidlere primer denir. Primerler, denatüre edilmiş DNA molekülünün iki zinciri birbirinden ayrı durumda iken, bu zincirlerin herhangi bir bölgesine komplementler özellikteki küçük bir yabancı DNA parçası eklenirse, bu yabancı DNA dizisi ilgili zincirin tamamlayıcısı olduğu bölgeye yapışır ve bu olaya da hibridizasyon denir

 

3. Polimeraz Enzimleri:

 PCR’ın kullanılmasını sağlayan en önemli faktör enzim DNA polimerazın (Taq Polimeraz) optimum çalışma ısısı 72ºC’dir. 97ºC’ye  kadar dahi dayanabilen bu enzim,reaksiyon başlamadan önce ortama ilave edilir ve çoğalma döngülerinin tam bir serisinde aktif olarak reaksiyonu sonlandırabilir.

4. Deoksinukleotid Trifosfot (dNTP) Karışımı:

Nükleik asit ya da yeni DNA sarmallarının sentezlenebilmeleri için; dATP, dTTP, dGTP, dCTP olarak bilinen 4 tip deoksinükleotidtrifosfata (dNTP) gereksinim duyulmaktadır.

 5. Mg+2:

 Mg iyonu, primer ile DNA arasındaki bağlanmayı ve DNA polimerazın kalıp-primer kopleksi ile birleşerek oluşturduğu replikasyon kompleksini stabilize eder. Mg+2 konsantrasyonu dNTP konsantrasyonundan fazla olmalıdır. Önerilen konsantrasyon aralığı 1-4mM’dır.

6. Tampon çözeltiler:

PCR için uygun tampon 10-50mM arasında değişen Tris HCL’dir. TrisHCl tamponun pH’sı ise 8,3-8,8 arasında değişir. Bu tampona 50mM’lık KCL çözeltisi eklenmesi primerlerin yapışmasını kolaylaştırır. PCR’da kullanılan standart solüsyonlar kısaca; Tris, KCI, MgCl2, Jelâtin ve Tween 20 olarak sıralanabilir.

 6. BİR STANDART PCR KARIŞIMI (15 μl için)

Deiyonize su: 5 μL

DNA: 2-3 μL (uygun konsantrasyonda)

Taq Buffer: 2 μL

dNTP: 0,5 μL (10 mM )

Primer (F)     :  1 μL (10Mm )

Primer (R)     : 1 μL (10 pmol’lü)

MgCl2: 1 μL (25 Mm )

DMSO: 1 μL (Toplam hacmin %5’i kadar olmalı )

 

 7. PCR KULLANIM ALANLARI

 1. DNA’nın dizi analizi ve DNA haritalamasında,

 2. İnsan genom projesindeki araştırmalarda,

 3. Genetik hastalıkların teşhisinde,

 4. DNA parmak izi analizinde,

 5. Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde,

 6. Allellik dizi varyasyonlarının gösterilebilme doku tipinin belirlenmesinde

 7. Tarımda (tohum saflığının belirlenmesi),

 8. Sistematik ve evrim çalışmalarında (doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesinde),

 9. Klonlama deneylerinde

 10. Mutagenez çalışmalarında,

 11. Fosil DNA çalışmalarında,

 

 8. PCR ÇEŞİTLERİ:

 • Hot-start PCR

• Touch down PCR

• Nested PCR

• Inverse PCR

• AP-PCR/RAPD

• RT-PCR (RT: Revers transkriptaz )

• Multiplex-PCR

• Q/C-PCR

• Asymmetric PCR

• in situ PCR

 



Bir Cevap Yazın

E-posta hesabınız yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir

*

Şu HTML etiketlerini ve özelliklerini kullanabilirsiniz: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>

Powered by ~AG